新冠患者康复后会反复或再感染？首份新冠抗体研究值得细读（组图）

4月14日，武汉市卫健委启动新冠病毒无症状感染者血清流行病学调查，本次调查采取定点随机抽样的原则，共100个社区作为调查点，抽样人次总计约1.1万人。这份血清流调结果出来之前，围绕新冠患者血清中抗体的讨论已越来越多。

近日，复旦大学附属上海公共卫生临床中心、复旦大学基础医学院病原生物系及医学分子病毒学教育部/卫生部重点室的研究团队在预印本网站医学预印版网站medRxiv上发表了题为“Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications（新冠肺炎康复患者队列中对新冠病毒的抗体反应及其意义）”的研究论文。该研究尚未经同行评议。

他们的研究结果显示，来自175名康复患者血清样本分析发现，中和抗体（Nabs）在患者发病后的10-15天达到峰值，随后保持稳定。有30%的患者产生的中和抗体滴度非常低，其中，有10名康复患者体内的抗体滴度未达到可检出的极限值。2例患者的中和抗体滴度非常高，但未出现任何抗体相关的不良反应。

研究团队指出，这些结果表明，感染新冠病毒的患者中，有一部分能够在没有出现高滴度病毒特异性抗体的情况下康复。这些患者如何在没有中和抗体的帮助下康复，以及是否存在病情反复或再感染的较高风险，都有待进一步研究。

值得注意的是，这项研究发现COVID-19患者的中和抗体滴度还与患者的年龄相关，中老年患者产生的中和抗体滴度远高于年轻患者的抗体滴度。

该研究的通讯作者为复旦大学基础医学院教授黄竞荷、复旦大学附属上海市公共卫生临床中心副研究员吴凡。黄竞荷长期从事艾滋病广谱中和抗体及流感疫苗的研究，她开创性地开发了一种直接从B淋巴细胞中分离抗体的新技术 （Nature Protocols 2013）。在她此前的研究工作中，已经从艾滋病病人体内分离到一系列的新型高效广谱中和抗体10E8、35O22和N6。

此次这项最新研究是第一份关于从COVID-19康复患者队列的血浆中提取中和抗体的研究报告，可能为血浆疗法等被动抗体治疗和针对新冠病毒的疫苗开发提供有用的信息。中和抗体滴度与患者年龄、淋巴细胞计数和血液CRP水平的相关性也为进一步探讨COVID-19患者中和抗体的发生机制奠定了基础。

目前已知的是，中和抗体在病毒清除中起着重要的作用，可用于保护或治疗病毒性疾病。通过感染或接种疫苗诱导的病毒特异性中和抗体具有阻断病毒感染的能力。而中和抗体水平也已被用作评估天花、脊髓灰质炎和流感病毒疫苗有效性的金标准。

与此同时，血浆疗法等被动抗体治疗曾被成功用于治疗传染性病毒性疾病，包括SARS-CoV、流感病毒和埃博拉病毒。被动抗体治疗的有效性与血浆中中和抗体的浓度或康复患者中抗体的浓度有关。COVID-19全球大流行背景下，血浆疗法也被认为是一种有希望的感染预防或疾病治疗的方法。

然而，研究团队提到，目前COVID-19患者中新冠病毒特异性中和抗体的水平和作用尚未见报道。因此，他们采用安全、灵敏的基于假病毒-慢病毒载体的中和分析方法，对来自上海公共卫生临床中心的175例轻度症状康复患者的血浆进行了筛选和测定。

假病毒（PsV）中和试验是一种灵敏、可重复的方法，它不会产生任何高致病性病毒，可以在生物安全二级设施中安全处理。该方法此前广泛用于多种高致病性病毒（包括埃博拉病毒、高致病性流感病毒、SARS-CoV、MERS-CoV）的中和抗体检测。

截至2020年2月26日，共有175名COVID-19患者从上海公共卫生临床中心康复出院。他们的症状轻微，没有人进过ICU。患者的中位年龄为50岁（16-85岁）；女性患者占比53%。住院时间中位数为16天（7-30天），疾病持续时间中位数为21天（9至34天）。

值得注意的是，针对新冠患者是否会发生再感染即“复阳”的现象，中国医学科学院医学实验动物研究所所长秦川等人此前在恒河猴身上也提供过相关信息，答案比这次黄竞荷等人的研究相对乐观。

他们分析，从研究团队目前对猴子的纵向研究来看，如果猴子在初次感染后的早期产生中和抗体，则不会发生再感染。这也就意味着，康复患者在建立了足够的特异性抗体以产生对新冠病毒的免疫力时，就不会再被传染。他们认为，此前出院患者的‘复阳’不可能是由于再感染所致，需要考虑更复杂的问题来找出原因。”

新冠病毒和SARS-CoV的抗原表位或免疫原性是不同

研究团队收集了5例COVID-19患者出院时的血浆样本，测试了293T/ACE2细胞对新冠病毒感染的中和效价。所有5例血浆均表现出对293T/ACE2细胞的新冠病毒PsV感染的浓度依赖性抑制。高滴度中和抗体的血浆显示出更高滴度的新冠病毒RBD、S1和S2特异性结合抗体。

此外，这些患者的血浆也表现出与新冠病毒RBD和S1区域的交叉结合，但与SARS-CoV S蛋白的结合和新冠病毒S蛋白的结合并不一致。此外，在PsV中和试验中，COVID-19患者血浆不能抑制SARS-CoV感染。

来自COVID-19患者、显示出较强的新冠病毒中和活性的26份血浆样本，既不能中和SARS-CoV PsV感染，也不能抑制VSV-G PsV感染。

这里有一个前提是，因为新冠病毒和SARS-CoV之间在S蛋白上氨基酸一致性为77.2%，保守表位可能存在于两种病毒之间。但这项研究的结果表明，尽管COVID-19患者的血浆显示与SARS-CoV存在交叉结合，但并没有中和SARS-CoV。这就提示，新冠病毒和SARS-CoV的抗原表位或免疫原性是不同的。

研究团队提到，本研究推断的证据仅表明，在COVID-19感染期间，针对SARS-CoV和新冠病毒保守表位的交叉中和抗体可能不易被诱导。

患者感染后第10-15天产生中和抗体和结合抗体

研究团队监测了疾病进程中新冠病毒特异性中和抗体的发展动力学，对6例患者发病后不同时间点的血浆进行测定，患者之间中和抗体的发展动力学相似。所有患者中和抗体的滴度在发病第10天前较低（ID50: < 200），在发病第10-15天时升高达到峰值，随后保持稳定。

研究人员还测试了这6例患者血浆中新冠病毒S蛋白（刺突糖蛋白）不同结合域（RBD、S1和S2）的结合抗体。中和抗体(右Y轴)和针对RBD（受体结合域）、S1和S2的结合抗体(左Y轴)的动力学一致。

S蛋白是冠状病毒最重要的表面蛋白，它通常决定病毒的宿主范围和特异性，是宿主中和抗体的重要位点以及疫苗设计的关键靶点。此前的研究表明，冠状病毒通过S蛋白与受体ACE2结合，从而介导膜融合和病毒入侵。S蛋白根据蛋白结构功能又被分为两个功能单位，即S1和S2蛋白亚基。

研究团队评估了175名康复患者出院当天血浆中新冠病毒特异性中和抗体滴度和S蛋白结合抗体的水平。他们观察到，新冠病毒特异性中和抗体滴度与靶向RBD、S1和S2的S蛋白抗体中度相关。

他们认为，这提示COVID-19患者对新冠病毒的体液免疫反应发生在感染后第10-15天。除了RBD结合域外，S2区域可能是新冠病毒中和抗体的目标。

不过，由于结合抗体也可能通过抗体依赖的吞噬作用或抗体依赖的细胞毒性作用来清除病毒，因此中和抗体和结合抗体对疾病进展的影响值得进一步综合评价。

总体来说，大多数COVID-19患者在感染康复期出现了新冠病毒特异性中和抗体。中和抗体滴度在发病后10-15天达到峰值，此后在患者中保持稳定。针对S蛋白不同结构域（包括S1、RBD和S2）的抗体，都可能有助于中和。

大约30%的康复患者产生非常低滴度的中和抗体

值得注意的是，研究团队观察到，175名康复患者的血浆中和抗体滴度是存在差异的。ID50s的范围从低于检测限（<40）到21567。大约30%的康复患者产生一个非常低水平的中和抗体滴度（ID50: < 500）。不过，这些患者的病程与其他患者相似。

其中10例患者的中和抗体滴度还在检测极限以下（ID50: < 40）。他们认为，这表明包括T细胞或细胞因子在内的其他免疫反应可能有助于这些患者的恢复。

另一方面，2例患者的中和抗体滴度非常高，ID50分别大于15989和21567，但未出现任何抗体相关的不良反应。

总体来说，大约17%、39%、14%的患者分别显示中低（ID50: 500-999）、中高（ID50: 1000-2500）、高（ID50: > 2500）中和抗体滴度。

研究团队还收集并测试了175名患者中47名患者出院后两周的随访检查中血浆中的中和抗体水平。如图3C所示，随访检查时采集的中和抗体血浆滴度与出院时采集的无显著差异。出院时未产生中和抗体的患者此后也未出现中和抗体。

他们认为，这些结果表明，感染新冠病毒的患者中，有一部分能够在没有出现高滴度病毒特异性抗体的情况下康复。这些患者如何在没有中和抗体的帮助下康复，以及是否存在病情反复或再感染的较高风险，都有待进一步研究。

需要注意的是，在使用恢复期血浆进行预防或治疗之前，在进行被动抗体治疗前，需要对来自康复供体的血浆和血清进行滴定，这是有帮助的。研究团队提醒，这也是一项简单的工作，可以使用PsV中和试验来完成。

中老年康复患者出现更高水平的中和抗体

COVID-19患者的中和抗体滴度还与患者的年龄相关。

研究团队观察到，老年患者比年轻患者更容易诱导更高滴度的中和抗体。如图4A所示，他们根据年龄将患者分为三组，分别为年轻人（15-39岁）、中年人（40-59岁）和老年人（60-85岁），每组患者数量差不多，分别为55例、64例和56例。

中年、老年康复患者的中和抗体滴度明显高于年轻康复患者，对应的中位ID50s分别为1537、1255、488。年龄与中和抗体滴度呈中度正相关，证实了年龄在中和抗体产生中的重要作用。中老年康复患者的RBD、S1和S2靶向抗体明显高于年轻康复患者。然而，患者的年龄和住院时间之间没有观察到差异。

研究团队认为，这些结果提示高水平中和抗体对清除病毒有一定的作用，对中老年患者的康复有一定的帮助。

另外，COVID-19康复患者的年龄和新冠病毒特异性中和抗体与入院时淋巴细胞计数呈负相关，与CRP水平呈正相关。

值得注意的是，目前的研究显示，年龄是冠状病毒感染（包括SARS-CoV、MERS-CoV和新冠病毒）后不良疾病预后的重要预测因素。此前对感染SARS-CoV的恒河猴的研究则表明，年龄较大的恒河猴会引起先天免疫应答升高，导致比年轻的成年恒河猴呈现更严重的病理反应。

在这项研究中，中老年患者入院时淋巴细胞计数较年轻患者低，CRP水平较高。不过，这些患者均未发展成严重病情，且年龄和住院时间在这些患者中无显著差异。

研究团队还观察到中和抗体滴度与血液淋巴细胞计数呈负相关，与血液CRP水平呈正相关，这表明在细胞反应功能障碍或受损时，体液反应可能发挥重要作用。老年患者入院时血CRP水平较高，淋巴细胞计数较低，提示先天性免疫应答较年轻患者强烈。这些老年患者中，高水平的中和抗体可能是免疫反应强烈的结果。

不过，高水平的中和抗体是否能保护这些患者免于进展为严重和危重状态，值得综合评价。但在这项研究中，严重和危重患者被排除在研究之外，因为在收集样本之前他们已接受了被动抗体治疗。

论文提醒，在本研究中，研究团队不能直接评价中和抗体对COVID-19患者病毒清除或疾病进展的影响。为解决该问题，应该进行进一步的全面研究。